BAG2019

BIOINFORMÁTICA APLICADA À GENÔMICA: INTRODUÇÃO À ANÁLISE DE DADOS DE SEQUENCIAMENTO DE NOVA GERAÇÃO (Turma SP - 2019)

Instrutores

• Dra Andréa Laurato Sertié
• Dra Karina Griesi Oliveira
• Msc Murilo Cervato
• Msc Renato Puga

Install

• Mac

# historico completo homebrews
git -C "$(brew --repo homebrew/core)" fetch --unshallow

# install java
brew install java

# install samtools
brew install samtools

# install 
brew install fastqc

• Windows
  • VirtualBox - Cliente para montar nossa Virtual Machine Linux VirtualBox
  • Bio-Linux 8 - Download .ISO

Bioinformática: Pipelines e Comandos

Olá, bem vindo ao curso de BIOINFORMÁTICA APLICADA À GENÔMICA: INTRODUÇÃO À ANÁLISE DE DADOS DE SEQUENCIAMENTO DE NOVA GERAÇÃO, aqui encontrará um guia do curso para executar comandos e pipelines de bioinformática.

Olá Ambiente de Bioinformática

Linux: O Linux é um sistema operacional, assim como o Windows da Microsoft e o Mac OS da Apple. Ele foi criado pelo finlandês Linus Torvalds, e o nome é a mistura do nome do criador com Unix, um antigo sistema operacional da empresa de mesmo nome. O que é Linux?.

Pipelines: Primeiro, o pipeline não é um termo de bioinformática, é na verdade um termo de ciência da computação, envolve encadeamento de processos / threads / funções etc. Em resumo, o resultado de um processo é a entrada de um novo processo na sequência. A review of bioinformatic pipeline frameworks

Qual ambiente vamos utilizar?

Vamos utilizar uma instância na Amazon Cloud com Sistema Operacional Linux Ubuntu 14.04. Os programas para que possamos criar nosso pipeline de análises de sequenciamento de nova geração já foram instalados e serão apenas listados nesse documento. O objetivo é melhorar a experiência de usuários iniciantes em "digitar comandos em um terminal linux" e ser um roteiro para que todos possam se localizar.

Estrutura de Diretórios

Estrutura de diretórios: sequências, programas e arquivos de referência.

• /bioinfo
  • /bioinfo/app
  • /bioinfo/data
    • /bioinfo/data/fastq
  • /bioinfo/reference

Programas Instalados

Listamos os programas previamente instalados em nosso ambiente para executar o pipeline de chamada de varinates:

• annovar Download
• bcftools Download
• bedtools Download
• bwa Download
• FastQC Download
• freebayes Download
• samtools Download
• cutadapt Download

Primeiros Comandos

# ls para listar arquivos e diretorios
ls

# pwd para informar o diretorio atual
pwd

# cd para entrar e sair de diretorios e voltar para casa
cd resultados/
cd ../
cd

Fonte: Comandos Básicos do Terminal Linux

Diretório de Resultados

# volta para casa
cd

# mkdir para criar um diretorio
mkdir resultados

# cd para entrar no diretorio resultados
cd resultados/

# mkdir para criar o diretorio das amostras 003, 017 e 019
mkdir 003 017 019

Download das Referências

Nesta estapa vamos utilizar dois cromossomos humanos (chr13 e chr17), nossos genes de interesse são: BRCA1 e BRCA2. NCBI BRCA 1 and 2

Acessar o site: Sequence and Annotation Downloads

cd /bioinfo/reference

# wget para fazer download do chr13
wget -c http://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg19/chromosomes/chr13.fa.gz

# wget para fazer download do chr17 
wget -c http://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg19/chromosomes/chr17.fa.gz

# cat para concatenar os arquivo do cromossomo 13 e 17 em hg19.fa
zcat chr13.fa.gz chr17.fa.gz > hg19.fa

# rm para deletar os arquivos chr13.fa e chr17.fa
rm chr13.fa chr17.fa

BWA: index reference

Agora, é preciso indexar o arquivo FASTA da referência. Todos os programas de alinhmaneto tem esta etapa que otimiza o processo de alinhamento das nossas sequências na referência.

NOTA: A etapa de index é feita apenas uma vez para cada arquivo de referência:

# bwa index para gerar o index da referencia hg19.fa
bwa index hg19.fa 

FastQC: Relatório de Controle de Qualidade

Gerar relatório de controle de qualidade com FastQC (Tempo ~10s):

# fastqc para gerar relatorio de qualidade dos arquivo FASTQ
# opcao (-o ./) diz para salvar o resultado no mesmo arquivo em que o comando esta sendo rodado.

# cd para voltar para a casa
cd

# rodar fastqc e salvar o resultado de cada amostra em seu diretorio
fastqc -o resultados/003/ /bioinfo/data/fastq/003.fastq.gz 

FastQC 003 resultado

Tarefa 01: Repetir o processo para as amostras 017 e 019

~10 min

#cutadapt: localizar e remover adaptadres O Cutadapt localiza e remove sequências de adaptadores, primers, caudas poly-A e outros tipos de sequência indesejada. Aqui vamos utilizar as funções para "trimar" sequências pequenas e maiores do que o esperado. (Tempo ~3s):

 -m LEN[:LEN2], --minimum-length=LEN[:LEN2]
                        Discard reads shorter than LEN. Default: 0
 -M LEN[:LEN2], --maximum-length=LEN[:LEN2]
                        Discard reads longer than LEN. Default: no limit
 
# cd para voltar para a casa
cd

# cutadapt para remover sequencias de tamanho menores 100pb e maiores que 220
cutadapt --minimum-length 100 --maximum-length 220 -q 15  -o resultados/003/003.cutadapt.fastq  /bioinfo/data/fastq/003.fastq.gz

003.cutadapt.fastq resultado

Tarefa 02: Repetir o processo para as amostras 017 e 019

#BWA-mem: maximal exact matches Alinha sequencias de tamanho 70bp-1Mbp com o algoritmo BWA-MEM. Em resumo o algoritmo trabalha com "alinhamento por sementes" com maximal exact matches (MEMs) e então estendendo sementes com o algoritmo Smith-Waterman (SW). Link. Tempo (~60s):

# cd para voltar para casa
cd

# rodar bwa para alinhar as sequencias contra o genoma de referencia
bwa mem -R '@RG\tID:CAP\tSM:CAP01_NGSA\tLB:Agilent\tPL:illumina' \ 
~/references/hg19.fa \
/bioinfo/data/fastq/003.fastq.gz > resultados/003/003.sam

BWA-mem 003 resultado

Tarefa 03: Repetir o processo para as amostras 017 e 019

#samtools: fixmate, sort e index

samtools fixmate

Preencha coordenadas de posicionamento, posicione FLAGs relacionadas a partir a alinhamentos classificados por nome. Tempo (~5s):

samtools fixmate resultados/003/003.sam resultados/003/003.bam

SAMTOOLS fixmate 003 resultado

Tarefa 04: Repetir o processo para as amostras 017 e 019

Tempo: ~10min

samtools sort

O samtools sort vai ordenar de nome para ordem de coordenadas. Tempo (5s):

time samtools sort -O bam \ 
-o resultados/003/003_sort.bam -T /tmp/ resultados/003/003.bam 

SAMTOOLS sort 003 resultado

Tarefa 05: Repetir o processo para as amostras 017 e 019

Tempo: ~1min

samtools index

O samtools index cria um index (.BAI) do arquivo binário (.BAM):

samtools index resultados/003/003_sort.bam 

SAMTOOLS index 003 resultado

Tarefa 06: Repetir o processo para as amostras 017 e 019

Tempo: ~1min

#freebayes: chamador de variantes O FreeBayes é um detector variante genético Bayesiano projetado para encontrar pequenos polimorfismos, especificamente SNPs (polimorfismos de nucleotídeo único), indels (inserções e deleções), MNPs (polimorfismos de múltiplos nucleotídeos) e eventos complexos (eventos compostos de inserção e substituição) menores que os comprimento de um alinhamento de seqüenciamento de leitura curta. Link. Tempo (~6min):

freebayes -f ~/references/hg19.fa \ 
-F 0.01 \
-C 1 \
--pooled-continuous resultados/003/003_sort.bam > resultados/003/003.vcf

Parâmetros

```bash
 -C --min-alternate-count N
                   Require at least this count of observations supporting
                   an alternate allele within a single individual in order
                   to evaluate the position.  default: 2

 --pooled-continuous
                   Output all alleles which pass input filters, regardles of
                   genotyping outcome or model.

FREEBAYES call variant 003 resultado

Tarefa 07: Repetir o processo para as amostras 017 e 019

Tempo: ~10min

annovar: anotador de variantes

ANNOVAR éma ferramenta eficiente para anotar funcionalmente variantes genéticas detectadas a partir de diversos genomas (incluindo o genoma humano hg18, hg19, hg38, bem como mouse, verme, mosca, levedura e muitos outros). [Link]. Aqui vamos converter .VCF para .avinput. Tempo (~5s):

perl /bioinfo/app/annovar/convert2annovar.pl \
-format vcf4 resultados/003/003.vcf > resultados/003/003.avinput

ANNOVAR convert2annovar 003 resultado

Tarefa 08: Repetir o processo para as amostras 017 e 019

Anotar as variantes chamadas utilizando algumas bases de dados públicas: Tempo (~5s).

perl /bioinfo/app/annovar/table_annovar.pl \ 
resultados/003/003.avinput /bioinfo/app/annovar/humandb/ \
-buildver hg19 -out resultados/003/003 -remove \ 
-protocol refGene,exac03,clinvar_20180603 -operation g,f,f -nastring .

Tarefa 09: Repetir o processo para as amostras 017 e 019

ANNOVAR table_annovar 003 resultado